Máy Tính Liên Kết
Danh mục: Sinh họcVector DNA
Insert DNA
Cài Đặt Phản Ứng Ligation
Cài Đặt Phản Ứng Hoàn Chỉnh
| Thành Phần | Thể Tích (μL) | Số Lượng Cuối |
|---|---|---|
| Vector DNA (50 ng/μL) | 1.0 | 50 ng |
| Insert DNA (25 ng/μL) | 0.33 | 8.3 ng |
| 10× T4 DNA Ligase Buffer | 2.0 | 1× |
| T4 DNA Ligase | 1.0 | 400 U |
| Nước Không Chứa Nuclease | 15.67 | Đến 20 μL |
| Tổng Thể Tích | 20.0 |
Mẹo Tối Ưu Hóa
Dựa trên các tham số đầu vào của bạn, đây là một số khuyến nghị:
- Đối với đầu dính 5' với tỷ lệ vector:insert là 1:3, ủ ở 16°C trong 4 giờ.
- Xử lý CIP cho vector sẽ giúp giảm nền tự ligation.
- Nếu hiệu suất chuyển giao thấp, hãy thử tăng tỷ lệ insert:vector lên 5:1.
- Đối với ligation đầu bằng, tăng nồng độ ligase và kéo dài thời gian ligation.
- Ngừng hoạt động ligase ở 65°C trong 10 phút trước khi chuyển giao để có kết quả tốt nhất.
Về Ligation DNA
- Ligation DNA liên quan đến việc nối các đoạn DNA thông qua việc hình thành các liên kết phosphodiester.
- T4 DNA ligase cần ATP và Mg²⁺ để hoạt động đúng cách (được cung cấp trong dung dịch ligation).
- Ligation đầu dính hiệu quả hơn so với ligation đầu bằng.
- Tỷ lệ mol vector:insert thường dao động từ 1:3 đến 1:5 cho cloning tiêu chuẩn.
- Tỷ lệ insert:vector cao hơn (3:1 đến 10:1) được khuyến nghị cho ligation đầu bằng hoặc các insert lớn hơn.
- Dephosphorylation của các vector (sử dụng CIP, SAP, v.v.) ngăn chặn tự ligation của vector.
- Các hệ thống ligase nhanh có thể giảm thời gian ligation xuống còn 5-15 phút ở nhiệt độ phòng.
Công thức để chèn số lượng (ng):
\[ \text{Chèn ng} = \left( \frac{\text{Vector ng} \times \text{Kích thước chèn trong kb}}{\text{Kích thước vector trong kb}} \right) \times \left( \frac{\text{Số mol chèn}}{\text{Số mol vector}} \right) \]
Máy tính Ligation là gì?
Máy tính Ligation là một công cụ giúp các nhà nghiên cứu xác định lượng vector và DNA chèn cần thiết cho một phản ứng ligation thành công. Ligation DNA là một bước quan trọng trong nhân bản phân tử, nơi một DNA chèn được kết hợp với một vector plasmid bằng cách sử dụng một enzyme gọi là DNA ligase.
Nó hoạt động như thế nào?
Máy tính này cho phép người dùng nhập thông tin về vector và chèn của họ, bao gồm chiều dài và nồng độ. Dựa trên tỷ lệ mol đã chọn, nó tính toán lượng DNA chèn cần thiết để đạt được phản ứng ligation tối ưu.
Tính năng chính
- Tính toán tỷ lệ mol vector đến chèn cho các kịch bản nhân bản khác nhau.
- Hỗ trợ cả tỷ lệ mol tiêu chuẩn và tùy chỉnh.
- Cung cấp khuyến nghị cho các điều kiện ligation dựa trên nhân bản đầu dính hoặc đầu bằng.
- Bao gồm mẹo tối ưu hóa để cải thiện hiệu quả ligation.
Cách sử dụng máy tính
- Nhập chiều dài vector (bp) và nồng độ (ng/μL).
- Nhập chiều dài chèn (bp) và nồng độ (ng/μL).
- Chọn tỷ lệ mol vector đến chèn mong muốn (ví dụ: 1:3, 1:5).
- Xác định tổng thể tích phản ứng (ví dụ: 20 μL).
- Đối với các cài đặt nâng cao, chọn nhiệt độ ligation, thời gian, loại ligase và tùy chọn xử lý vector.
- Nhấn “Tính toán” để tạo ra lượng chèn được khuyến nghị và thiết lập phản ứng.
Các câu hỏi thường gặp
Tỷ lệ mol vector đến chèn tối ưu là gì?
Đối với các ligation đầu dính, tỷ lệ vector đến chèn 1:3 hoặc 1:5 thường được khuyến nghị. Đối với các ligation đầu bằng, tỷ lệ cao hơn (ví dụ: 1:5 đến 1:10) có thể cải thiện hiệu quả.
Tại sao nên khử phosphoryl hóa vector?
Khử phosphoryl hóa (sử dụng CIP, SAP hoặc Antarctic Phosphatase) ngăn chặn việc tự ligation của vector, giảm thiểu các thuộc địa nền không mong muốn.
Tôi nên sử dụng điều kiện ligation nào?
- 16°C trong 4 giờ – Điều kiện tiêu chuẩn cho T4 DNA ligase.
- Nhiệt độ phòng trong 15 phút – Phù hợp cho Quick Ligase.
- Qua đêm ở 16°C – Được khuyến nghị cho các ligation khó khăn hoặc nhân bản đầu bằng.
Làm thế nào tôi có thể cải thiện hiệu quả ligation?
- Đảm bảo tỷ lệ mol chính xác cho vector và chèn.
- Sử dụng DNA ligase và đệm tươi.
- Tối ưu hóa điều kiện ligation (nhiệt độ và thời gian).
- Xác nhận sự hiện diện của chèn qua điện di gel trước khi ligation.
Tại sao sử dụng máy tính này?
Máy tính Ligation này đơn giản hóa việc thiết lập các phản ứng ligation DNA, giúp các nhà nghiên cứu xác định đúng lượng vector và chèn cho việc nhân bản hiệu quả. Bằng cách tự động hóa các phép tính và cung cấp mẹo tối ưu hóa, nó tiết kiệm thời gian và tăng tỷ lệ thành công của các thí nghiệm ligation.